가. 균주 기원 / 사용 이력
 
1) 기원 및 개발 경위

• 기원; 미생물 원료가 나라, 지역마다 여러 이름으로 불리어질 수 있기에 표준화된 이름인 학명을 기재하며, 학명은 속명(genus name)과 종명(specific name)으로 표기하며, 균주명(strain name)은 학명 뒤에 일반체로 작성함
  
• * 학명은 속명 이하(속, 종, 변종·아종·품종 등)만을 표기하는 이명법(Binomial Nomenclature)을 사용하고, 국제세균명명규약(ICNB, International Code of Nomenclature of Bacteria)를 따름
  
• 같은 속에 병원성 미생물이 있는지, 분류학적으로 병원성 미생물과 구분이 되는지, 같은 속 내 독소 유전자를 보유하고 있는 미생물 종이 있는지 등이 기재되어야 함.
  
• 개발경위; 어느 나라에서, 어떤 경위로 분리/개발되었는지 작성함. 특성에 따라 사용목적이 다양하므로, 사용목적을 명확히 해야 함

 
2) 국내·외 인정·허가 현황

• 제외국의 인정·허가 현황 및 기준·규격
  다른 국가에서 인정·허가된 사례(US FDA GRAS, EU EFSA QPS 등)가 있다면 언제, 어떤 내용(사용조건, 기준·규격 등)으로 인정되었는지, 인정·허가를 증빙할 수 있는 자료 (예: 인정서, 허가서 사본 및 인정 사항 등이 명시된 해당 국가 식품관련 부처 홈페이지 자료 등)를 첨부함
  
• (Codex Alimentarius Commission, CAC) 등 국제기구에서 검토 중인 경우에는 검토 단계, 안전성 평가 결과, 기준·규격 등 진행 사항을 기재함
  
• 다른 국가에서 식품 외에 생약(herbal medicine) 및 식이보충제(dietary supplement) 등으로 인정·허가된 현황 및 기준·규격도 조사하여 작성함

 
3) 국내·외 사용현황

• 국내에서 지역 한정적으로 민간에서 해당 원료를 식품 등으로 사용했다는 자료가 있는 경우, 사용 지역 및 기간, 사용 방법 및 목적, 사용량 및 빈도 등 관련 내용을 첨부함
  
• 국외에서 식품 등으로 사용실적이 있는 경우에는 사용국가 및 사용현황 (사용용도, 유통량, 제조회사, 섭취실태 등)을 작성함
  
• * 식품원료 사용가능 여부 판단을 위해 ‘식품으로 섭취한 경험 (history of safe use)’은 중요하므로, 가능한 많은 자료(판매 기간, 섭취 인구 및 섭취량 등)을 조사하여 첨부함

나. 전장유전체 염기서열 (Whole genome sequence)

•  원료 미생물의 전장유전체 염기서열을 complete genome 수준의 염기서열로 제출
• Complete genome 수준의 염기서열을 얻기 위해서는 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS)기술을 활용한 분석이 필요함 

 
1) 시퀀싱 전략

• Long-read 단독 또는 short-read와 long-read를 결합한 혼합(hybrid) 어셈블리(assembly) 방식을 적용하여함.
• * short-read 데이터와 long-read 데이터의 통합은 염색체 외 요소(플라미스드 등)를 포함한 genome의 완전성과 조립 신뢰도 측면에서 가장 우수한 결과를 제공함
• 현재 주로 사용되는 기술은 long-read의 경우 Pacbio, Oxford Nanopore, short-read의 경우 Illumina Hiseq, Miseq 등이 있음
• * 국내에는 위와 같은 전장유전체 염기서열 분석 서비스를 의뢰할 수 있는 회사가 다수 존재하며, 통상적으로 업체에 원료 균주 또는 상업용 kit로 추출한 2 μg 이상의 gDNA 제공 시 genome sequencing이 가능함

 
2) 시퀀싱 품질관리 기준

• 시퀀싱 reads의 품질관리/필터링에 사용한 프로그램 또는 소프트웨어 버전과 그 결과값을 보고하여하며, 다음 기준은 충족하여야 함
• 품질 점수 : Short-read은 per-base PHRED ≥ 20, long-read은 평균 PHRED ≥ 7
• 평균 read depth : 최소 30-fold 이상 (권장 100-fold) (고품질 조립 또는 완전 genome 확보에 충분한 coverage에 도달하여야 함)
• 오염도 : 기대 외 생물에 할당된 reads는 5% 미만이어야 하며, 초과 시 합리적 근거를 제시함. (사용한 프로그램, 소프트웨어 버전 및 데이터베이스 버전을 함께 보고하여야 함)

3) 라이브러리 제작

• 라이브러리 제작 프로토콜과 제조사 지침·버전을 보고하여야함
• 단편 크기 선택 시 소형 플라스미드가 유실되지 않도록 하여야 함

 
4) 어셈블리(assembly) 및 완전성 확인

• 완전 조립 genome (Complete geonme)을 제출하고, 완전성을 확인한 방법을 기술하여야 함 (예: replicon/염색체 수와 contig 수의 일치, contig 환형화 확인)
• 완전 조립을 달성하기 어려운 경우 다음을 보고함
• Contig 총 수(<1,000, 초과 시 근거 제시), 총 길이 및 N50
• 예상 게놈 크기 대비 ±20% 이내 여부(벗어날 경우 근거 제시)
• BUSCO 등 보존 유전자 세트에 대한 완전 일치율 ≥ 90%
• De novo assembly 시, assembler 소프트웨어, 주석(annotation) 수행 시 소프트웨어 및 데이터베이스 버전을 보고함

 
5) 전장데이터 데이터 제출 형식

• 전장유전체 데이터의 경우 다음과 같은 형식으로 제출함
  - 원시데이터(Raw data)의 경우, FASTQ 또는 비슷한 형식으로 제출함
  ​- 조립된 데이터(Assembled data)의 경우, FASTA 또는 비슷한 형식으로 제출함
• NGS에 대한 보다 구체적인 평가 방법은 「Next Generation Sequencing 기반 유전자 검사의 이해(심화용)」(식품의약품안전평가원, 2020)을 참고할 수 있음 

다. 안전성 관련 유전체 분석 자료

•  전장유전체 정보는 잠재적으로 우려되는 유전자의 존재 여부를 확인할 수 있음
• 확보한 전장유전체 정보를 기반으로 안전성과 관련된 유전자 데이터베이스를 활용하여 유전체 속에 들어있는 항생제 내성, 독성/병원성, 이동성 유전자 분석 결과를 제출하여야 함

 
1) 항생제 내성 유전자

• 분석 시 최소 2종 이상의 항생제 내성 데이터베이스를 활용하며, 사용한 데이터베이스명 및 버전 정보를 명확히 기재해야 함
• Identity ≥ 80%, Coverage ≥ 70%를 기본 판정 기준으로 적용함
• Coverage가 70% 미만이더라도 동일 AMR 유전자에 대해 Identity ≥ 80%인 단편(flagment)가 2개 이상 확인되는 경우 이를 기재하고, full-length 유전자의 존재 여부를 추가로 확인하여야 함
• 데이터베이스 정보가 제한적인 균주에 대해서는 HMM 기반 탐색 도구를 병행하여 유전자 존재 여부를 확인할 것을 권장함
• 항생제 내성 유전자 데이터베이스 예시: CARD(Comprehensive Antibiotic Resistance Database), Resfinder, AMRFinderPlus 등이 있음

 
2) 독성/병원성 유전자

• 분류군에 따라 알려진 독성 인자를 암호화하는 유전자 또는 독성 생성 관련 대사 경로의 존재 여부를 확인해야함
• Identity ≥ 80%, Coverage ≥ 70%을 보이는 쿼리 서열 일치 결과를 보고해야함
• Coverage가 70% 미만이더라도 동일 유전자에 대해 Identity ≥ 80%인 fragment가 2개 이상 확인되는 경우 보고하며, full-length 유전자 존재 여부를 추가 확인해야함
• 독성/병원성 유전자 데이터베이스 예시
  : 독성/병원성 유전자 데이터베이스 예시는 DBETH (Database of Bacterial ExoToxins for Human Health), VFDB (Virulence Factor Database) 등이 있음

 
3) 이동성 유전자

• : ACLAME(A CLAssification of Mobile genetic Elements)
• : MEF(Mobile Element Finder)
• 항생제 내성, 독성/병원성, 이동성 유전자 분석 결과 제출 시 사용한 데이터베이스와 사용 버전을 함께 제출하여야 함
• 유전체 분석 결과 안전성 위해요소 관련 유전자가 발견된 경우 해당 유전자의 기능적 무해성을 증명하는 추가 연구자료 제출이 필요하며, 이를 제출하지 못할 경우 식품원료로 사용할 수 없음